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分子生物学技术篇(1):分子生物学教学论文
一、优化实践教学体系，设置独立的实践课
从2002年开始，我们结合我校人才培养目标及具体情况，制定了本科生《分子生物学实践》及《基因工程实践》的教学大纲，开设了相应独立的实践课程，设计了质粒提取、PCR技术、DNA电泳、限制性内切酶技术、DNA的片段的胶回收、外源基因的连接及重组DNA的转化、筛选和鉴定等最基本需要掌握的实践。同时，我们还自编了内容详细、操作具体的实践教材。从2002年第一次开课至今已经过去了十多年，实践课取得了一定的成绩，根据课上学生上课情况和完成的实践报告上看，学生反应良好，能积极动手动脑并提出问题，实践报告也完成得认真、仔细。学生掌握了这些基本实践的原理和操作，对将来从事中药相关领域的研究工作有一定的帮助。但是在这十多年的教学实践中，我们也发现了问题，由于该课程的实践内容全都是验证性实践，实践设计为“教师包办型”，从试剂配制到操作步骤教师都已经准备好，学生只是按照规定的步骤按部就班地做实践就行了，在这样的教学模式下学生的行为受到限制，对教师和教材依赖性强，限制了发挥学生主动思维的空间。
二、改革实践教学内容，强调综合性和连贯性
由于验证性实践限制了学生发挥主动思维的空间，因此，必须建立分子生物学实践教学创新培养新模式，从验证性实践过渡到以设计性、综合性实践为主，重点培养学生在科研中的综合思维能力及实际动手操作能力，变被动灌输为主动思考，为学生今后进实践室从事相关领域的科学研究做准备。我们在改革中强调实践的综合性和连贯性，如学习重组DNA技术时，我们安排了5个实践：重组质粒的提取，DNA的酶切，DNA凝胶电泳及片断的胶回收，外源基因的连接，重组DNA的转化、筛选及鉴定。这五个实践包括了重组DNA技术的五个核心内容“分、切、接、转、筛”。我们把这5个实践串联成一个综合实践，使其具有连贯性。每次实践结束时的样品正好是下次实践的材料，这些实践将变成一整套前后关联的有机整体，一环扣一环，只有这5个实践全部操作成功了，才能最后得到自己需要的克隆。这种综合性实践使学生在整个过程中面临着挑战，也使最终成功得到产物的学生有成就感；不仅能培养学生综合实践操作能力，还能培养学生团结协作的精神和对科学研究的兴趣。
三、开放型教学模式，提高教学质量
在传统的实践课教学中，学生除了在规定的上课时间，机械地完成规定的实践任务外，几乎没有机会进入实践室，学生的主观能动性得不到发挥。开放实践室，为学有余力的学生提供更多时间和空间显得很有必要的。但对于多数中医院校来说，由于实践室资源紧张，在开放方面一直实行得不够。这次，我们尝试对学生开放实践室，鼓励学有余力的学生进入实践室，开展相关的分子生物学实践研究，取得了一些成绩。我们首先在课堂上向学生介绍本课程组教师在课题研究中所用到分子生物学实践技术。有不少学生对教师的科研课题感兴趣，我们组织感兴趣的学生，在业余时间来课题组和教师一起进行了相关分子生物学的实践研究。通过和研究生共同实践，加强了理论课的知识。其次，我们组织学生利用所学到的分子生物学知识，以小组为单位，通过课下查阅资料，完成了科研小课题的实践设计。学生在课堂上讨论了他们设计的小课题，通过教师评价并与教师一起讨论，调动了学生的学习兴趣，激发了学生活跃的思维，通过讨论进一步修正方案，使其更加完善。同时，教师利用业余时间，组织感兴趣的学生进行了正式实践。最后，在课堂中，我们抽出15分钟，让做实践的学生讲了具体实践的体会和出现的问题，与大家分享成功的快乐和失败的经验。学生听得都非常认真，讨论得也很热烈，大家都觉得这种实践教学模式非常好，增长了很多知识，如果时间允许，希望能多些这种实践教学模式。
总之，通过分子生物学实践教学创新培养模式的尝试，取得了很好的反馈，既给学生介绍了先进的知识内容，拓展了视野，又激发了学生的学习兴趣，增强了学生对于学习医学分子生物学知识的学习热情，培养了他们的研究创新能力和科学素养。
分子生物学技术篇(2):细胞生物学课件
细胞生物学(Cell Biology)是在显微、亚显微和分子水平三个层次上，研究细胞的结构、功能和各种生命规律的一门科学。
第一章 绪论
第一节 细胞生物学研究 的内容与现状
一、细胞生物学是现代生命科学的重要基础学科
细胞生物学,是在显微、亚显微与分子水平等不同层次上研究细胞结构、功能及生命 活动规律的科学。
细胞生物学研究的对象是细胞。
细胞分子生物学是当前细胞生物学发展的主要方向。
细胞生物学研究的主要内容是 细胞的形态与结构、
代谢与调控、增殖分化、遗传变异、衰老与死亡、起源与进化、兴奋与运动以及细胞的传递等。
二、细胞生物学的主要研究内容大致可分为以下几 个方面：
(一 )细胞核、染色体以及基因表达的研究
(二 )生物膜与细胞器的研究
(三 )细胞骨架体系的研究
(四 )细胞增殖及其调控
（五 )细胞分化及其调控
(六 )细胞的衰 老与程序死亡
(七 )细胞的起源进化
(八 )细胞工程
细胞生物学不同于细胞学主要表现在：第一，深刻性。它从细胞整体结构，超微结构和分子结构对细胞进行剖析，并把细胞生命活动同分子水平和超分子水平联系起来。第二，综合性。这所研究的内容广泛涉及到许多学科领域，同生理学、遗传学、生物化学、
发育生物学等融合到一起。
三、当前细胞生物学研究的总体趋势与重点领域
（一）当前细胞生物学研究中的三大基本问题
1、细胞内的基因组是如何在时间与空间上有序表达的？
2、基因表达的产物如何逐级装配成基本结构体系及各种细胞器？
3、基因表达的产物如何调节细胞最重要的生命活动过程的？
（二）当前细胞基本生命活动研究的若干重大课题
1、染色体 DNA与蛋白质相互作用关系 —— 主要是非组蛋白对基因组的作用。
2、细胞增殖、分化、凋亡（程序性死亡）的相互关系及调控
3、细胞信号传导的研究
4、细胞结构体系的装配
第二节 细胞学与细胞生物学发展简史
一、细胞的发现
英国学者 胡克 于 1665年制造了第一台有科研价值的显微镜,第一次描述了植物细胞的构造,细胞的发现是在 1665年。 1677— 1683年，荷兰人 列文胡克 用自己设计好的显微镜 第一次观察到活细胞 。
二、细胞学说的建 立及其意义
1、建立,1838— 1839年德国植物学家施莱登和动物学家施旺提出,一切植物、动物都是由细胞组成的，
细胞是一切动植物的 基本单位，这就是著名的“细胞学说”。
2、细胞学说的基本内容：①一切有机体都是由细胞发育而来的，并由细胞和细胞产物所构成；②每个细胞是一个相对独立的单位，执行特定的功能；③细胞只能通过细胞分裂而来。
三、细胞学的经典时期这一时期的研究方法，主要是显微镜下形态的描述。
1、原生质理论的提出； 2、细胞分裂的研究； 3、重要细胞器的发现。
四、实验细胞学与细胞学的分支及其发展
1876年 O ·Hertwig以细胞为基础，对所有生物现象作一般性综合，他采用实验的方法研究海胆和蛔虫 发育中的核 质关系，实际上创立了实验细胞学。从此，实验的方法得到广泛的应用，使细胞学得到迅速的发展。
随着对细胞 认识的深入，开始了对细胞的遗传、细胞器功能、细胞生化代谢及生理的研究，于是便以细胞为中心，发展起来一些新兴学科，如细胞遗传学、细胞生理学、细胞化学。
五、细胞生物学学科的形成与发展细胞生物学的形成的基础是：①细胞超微结构的研究；
②细胞生物化学的发展；③ 70年代以来分子生物学的概念与技术引入细胞学。概括地说，细胞生物学是以细胞作为一切有机体进行生命活动的基本单位，在各个层次上（显微、亚显微、分子水平）研究细胞生命活动规律的学科。
其主要发展方向是细胞分子生物学。
思考题
1、细胞学说的基本内容是什么？恩格斯对细胞学说评价很高，为什么？ P9
2、细胞生物学与经典细胞学有什么区别？
3、当前细胞生物学研究的热点课题中你最感受兴趣的是哪些？为什么？
第二章 细胞基本知识概念
第一节 细胞的基本概念
一、细胞是生命活动的基本单位细胞是有膜包围的能进行独立繁殖的最小原生质团，
简单地说 细胞是生命活动的基本单位 。可以从以下角度去理解：①细胞是构成有机体的基本单位；②细胞是 有是代谢与功能的基本单位，有严格自动控制的代谢体系，
并且 有保证完成生命过程有序性的独立的结构装置 。③
有机体的生长发育是依靠细胞增殖、分化与凋亡来实现的。细胞是有机体生长发育的基础；④细胞具有遗传的全能性（除少数特化细胞），是遗传的基本单位。
二、细胞的基本共性细胞的基本共性有：①所有细胞都有细胞膜；②所有细胞都有 DNA与 RNA；③细胞都有核糖体；④细胞都以一分为二的方式分裂增殖。这些是细胞结构与生存不可缺少的基础。
第二节 非细胞形态的生命体 —— 病毒及其与细胞的关系一、病毒的基本知识病毒是由一个核酸分子 (DNA或 RNA)与蛋白质构成的非细胞形态的生命体 。类病毒仅由一个有感染性的 RNA构成。
朊病毒仅由有感染性的蛋白质构成。病毒是完整的寄生物。
根据核 酸类型不同，病毒 可分为 DNA病毒与 RNA病毒。
依据宿主可分为动物病毒、植物病毒和细菌病毒（噬菌体）等。
二,病毒在细胞内的增殖（复制）
病毒的增殖又称病毒的复制,病毒的增殖必须在细胞内进行 。
病毒在宿主细胞内分别复制病毒核酸与翻译病毒蛋白，然后将核酸与蛋白装配成病毒的基本结构。
其复制过程大到可分为：
侵染，脱去衣壳，早基因的复制与表达，晚基因的复制、结构蛋白质的合成，装配、成熟与释放等过程。
三、病毒与细胞在起源和进化中的关系病毒可能是细胞在特定条件下“扔出”的一个基因组，或者是具有复制与转录能力的 mRNA。这些游离的基因组只有回到它们原来的细胞内环境中才能进行复制与转录。
第三节 原核细胞与古核细胞
种类繁多的细胞可以分为原核细胞与真核细胞两类大类。
近年有些生物学家建议将生物划分原核生物、古核生物和真核生物三大界，将细胞相应分为三大类型：
原核细胞、古核细胞与真核细胞。
原核细胞无典型的细胞核，其基本特点：①遗传物质仅由一个裸露的环状 DNA构成；②细胞内没有分化出以膜为基础的细胞器与细胞核膜。
原核细胞大约出现在 35亿年前,包括支原体、衣原体、立克次体、细菌、放线菌及蓝藻 (蓝细菌 )等 6类。
一、支原体支原体是目前发现的最小、最简单的细胞,直径只有 0.1~0.3μm,能在体外生长，也能寄生在细胞内。
二、原核细胞的两个代表 —— 细菌和蓝藻
（一）细菌细菌有 3种形态：球菌、杆菌、螺旋菌。
在进化上，细菌又可分为原细菌（古细菌）与真细菌两类大类。
1,细菌细胞的核 区与基因：
一个环状的 DNA分子盘绕在核区，没有或有极少的组蛋白，无明显的 Feulgen正反应。 DNA复制不受细胞分裂周期的限制，可以连续进行,且 DNA复制、
RNA转录、蛋白质翻译可以同时进行,这是细菌乃至整个原核细胞器与真核细胞最显著的差异之一。
2、细菌细胞的表面结构：
主要指细胞膜、细胞壁及其特化结构 (中膜体、荚膜、鞭毛等 )。细胞膜是细胞表面的重要结构。
细胞膜 的功能包括：①选择性地物质运输；②细菌细胞膜含有丰富的酶系，执行重要的代谢功能。
中膜体 由细胞膜内陷形成，可能起 DNA复制的支点作用。
细胞壁 的 共同成分是肽聚糖,革兰氏阳性菌与阴性菌细胞壁成分与结构差异明显。
荚 膜 是某些细菌表面的特殊结构，是位于细胞壁表面的一层粘液物质。
鞭 毛 是某些细菌的运动器官，结构简单
3、细菌细胞的核糖体
核糖体的沉降系数为 70S，由 50S大亚单位和 30S
亚单位组成。大亚单位含有 23S rRNA,5S rRNA和 30
多种蛋白质，对红霉素与氯霉素敏感；小亚单位含有
16S RNA与 20多种蛋白质，对四环素与链霉素敏感。
4、细菌细胞核外 DNA
核外 DNA：质粒。 裸露的环状 DNA，能自我复制，
并可整合到核 DNA中。
5、细菌细胞的内生孢子
又称芽孢，是对不良环境有强抵抗力的休眠体。
内生孢子：细菌细胞内的重要物质 (特别是 DNA)，
积聚在细胞的一端，形成致密体，可度过恶劣环境。
细菌的增殖为直接分裂。
（二）蓝藻又称蓝细菌，是原核生物，又是最简单的自养植物类型之一。
蓝藻含有丰富的色素，可进行类似高等植物的光合作用。
其中央相当于细菌的核区；光合作用片层由藻胆蛋白构成，作用是将光能传递给叶绿素 a；细胞质内含物有的是储存的养料，有的功能不详；细胞膜外有细胞壁和胶质层 (鞘 )。
三、原核细胞与真核细胞的比较原核细胞与真核细胞的根本区别：①细胞膜系统的分化演变；②遗传信息量与遗传装置的扩增与复杂化。由于上述的根本差异，真核细胞的体积也相应扩增，细胞内部出现精密的网架结构 —— 细胞骨架。
二者的区别可分为两部分进行比较：
①结构与功能比较：真核细胞的生物膜将细胞分化为核与质两部分，细胞质又分化出各种细胞器，细胞骨架又保证了细胞形态的合理排布与执行功能的有序性
(P36 表 2-2)。
②细胞遗传装置与基因表达方式的比较：核膜使扩增了的遗传信息与复杂的遗传装置相对独立,使基因表达的程序有严格的阶段性与区域性 (P36表 2-3 )。
四、古核细胞（古细菌）
古细菌（又称原细菌）是一些生长在极端特殊环境中（高温或高盐）的细菌。最早发现的是产甲烷细菌类。
古核细胞的形态结构、遗传装置虽与原核细胞相似，但一些 基本分子生物学特点又与真核细胞接近。
现已有更多的论据说明真核生物可能起源于古核生物，
论据如下：
（ 1）古细菌的细胞壁成分与真核细胞一样；
（ 2）古核细胞 DNA中有重复序列的存在；
（ 3）具有组蛋白；
（ 4）古核细胞的核糖体与真细菌的差异很大，从对抗生素的反应看，应更类似真核细胞的核糖体；
（ 5）根据对 5SrRNA的分子进化分析和二级结构的研究，认为古细菌与真核生物同属一类。而真细菌却与之差别甚远。
第四节 真核细胞的基本知识概要
一、真核细胞的基本结构体系
1、生物膜系统
细胞表面是一种多功能结构；核膜又把细胞分为细胞质与细胞核。
以生物膜系统为基础形成了各种细胞器。线粒体、
叶绿体、内质网、高尔基体及溶酶体等。
2、遗传信息表达结构系统
由 DNA— 蛋白质与 RNA— 蛋白质复合体形成的遗传信息载体与表达系统，一般以颗粒或纤维状的基础结构存在。包括染色质，核 仁、核糖体等。
3、细胞骨架系统
细胞骨架由特异的结构蛋白质构成网架系统，可分为胞质骨架与核骨架。
二、细胞大水及其分析
细胞体积的守恒规律。
三、细胞形态结构与功能的关系
细胞的形态与功能具有相关性与一致性。
四、植物细胞与动物细胞的比较
植物细胞特有的细胞器：细胞壁（ 主要成分是纤维素 ）、液泡、叶绿体等； 而动物细胞的中心粒在植物细胞中不常见到。
思考题
1、如何理解细胞是生命活动的基本单位？ P17
2、细胞有那些基本共性？ P19
3、比较原核细胞与真核细胞的主要差异？ P35
4、比较植物细胞与动物细胞的主要差异？ P45
5、细胞的结构与功能的相关性观点是学习细胞生物学的重要原则之一，你是否能提出一些更有说服力的论据来说明这一问题？
第三章 细胞生物学研究方法
第一节 细胞形态结构的观察方法
一、光学显微镜技术
1、普通复式光学显微镜技术
普通光学显微镜（ 最大分辨率为 0.2μm）,主要由三部分组成：①光学放大系统，即目镜和物镜；②照明系统；③机械和支架系统。
显微镜的性能优劣决定于它的分辨率。 分辨率是指显微镜区分开相近两点的能力。
D= 0·61λN · sin
分子生物学技术篇(3):生物技术专业毕业论文
导语：生物技术（biotechnology），是指人们以现代生命科学为基础，结合其他基础科学的科学原理，采用先进的科学技术手段，按照预先的设计改造生物体或加工生物原料，为人类生产出所需产品或达到某种目的。以下是生物技术专业毕业论文，提供给大家学习参考！
生物技术专业毕业论文
引言
蝗虫是农、牧、林业的主要害虫之一，有些种类甚至可造成毁灭性的灾害。因此，对蝗虫开展各方面研究都有很重要的意义[1]。为有效防治蝗虫灾害,必须正确识别蝗虫种类。有关蝗虫的分类研究已有很多报道[2],前人已采集了大量的标本,命名了大量的模式种,这些模式种构成了蝗虫系统分类的基础和框架,用分子生物学技术研究蝗虫分类和系统演化时,若能用到这些标本和模式种,可以极大地扩展蝗虫分类和系统演化的分子生物学研究范围,有助于建立正确和完善的分类体系,构建系统的发育树[3~5], 而提取高质量和高产量的基因组DNA是进行各种PCR、Southern 杂交、构建cDNA 文库及其它一些分子生物学研究的基础和前提[6]。
在实际工作中, 由于很难直接用活标本进行实验,常常使用的是干制标本或浸泡标本。而若标本保存不当,细胞内DNA 发生降解,则难以获得高质量的DNA模板,导致PCR 扩增结果不稳定甚至无扩增产物出现,给实验工作者带来诸多不便[7]。因此，为开展蝗虫分子系统学研究，需要通过试验寻找一种快速、简便、高质量抽提蝗总DNA的方法。 基因组DNA的应用十分广泛，提取方法在国内外亦有不少报道 [8~11] ，概括起来可分为两大类：
（1）盐析提取法；
（2）有机溶剂提取 法[12]。
本文分别用SDS-蛋白酶K消化法、饱和NaCl法、CTAB法三种不同的提取方法，综合其他各种昆虫基因组DNA提取方法的优点，对新疆草原的主要危害种类——西伯利亚蝗（Gomphocerus sibiricus）干制标本和无水乙醇保存的标本进行了基因组DNA的提取方法的比较，为进一步开展蝗虫分类学研究提供基础资料。
1 材料与方法
1.1实验材料
本实验所用蝗虫标本见表1。
表1 研究样本来源及保存方式
Table 1 Research sources and the preservation of samples
种名 采集地点 采集时间 保存方式
西伯利亚蝗 新疆哈密 2005年6月 干标本
西伯利亚蝗 新疆哈密 2005年6月 无水乙醇固定
1.2主要试剂：
(1) 提取试剂：Tris（三羟甲基氨基甲烷）、EDTA（乙二氨四乙酸）、 SDS（十二烷基硫酸钠）、蛋白酶K、酚、氯仿、异戊醇、无水乙醇、异丙醇、RNA酶、β-巯基乙醇、CTAB（十六烷基三甲基溴化铵）等。
(2) 电泳试剂：琼脂糖、TBE、溴酚兰、蔗糖等。
1. 3主要仪器：
台式冷冻高速离心机 D-37520 德国 电子天平
AL-204 梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司 座式自动蒸汽灭菌锅 ZDX-35SBI 上海申安医疗器械厂 热空气消毒箱
GRX-9203A 上海一恒科技有限公司 电热恒温水浴锅 DZKW-S-8 北京光明医疗器械厂 超净工作台
SW-CJ-IF 苏州安泰空气技术有限公司 冰箱
BCD-208K/ACJN 青岛海尔股份有限公司
电泳仪 DYY-2C
北京六一仪器厂 紫外分析仪
WD-9403B 北京六一仪器厂 凝胶成像仪、移液枪等。
1.4研究方法：
1.4.1 SDS-蛋白酶K消化法[12~14]
(1)试剂及溶液 A液：Tris 0.05 mol/L、NaCl 0.1 mol/L、EDTA 0.1 mol/L pH 7.0～8.0。 B液：5%的SDS C液：2 mg/mL的蛋白酶K
（2）操作方法：
1）取样：将蝗虫干标本和无水乙醇浸制标本用无菌三蒸水冲洗2～3 次;用无菌三蒸水浸泡48 h 以上,弃水；弃去浸泡液,取蝗虫后足股节肌肉,剪碎材料于装有0.8 mL匀浆液（A液）的1.5 mL Eppendorf 管中。
2）研磨: 与离心管相匹配的玻璃棒将样品研磨至匀浆状。
3）加入0.1 mL的5％SDS和0.1 mL的2 mg/mL蛋白酶K。
4）水浴：37℃水浴1～3 h，直至混合液消化得很清亮为止。
5）酚抽提：在混合液中加入等体积的平衡酚，上下缓慢颠倒十次，切勿剧烈振荡，在台式高速离心机上6 000 r/min离心10 min,取上清液。
6）重复步骤5：直至水相与酚相的界面处看不到白色的蛋白质层为止，取上清液。
7）氯仿∶异戊醇(24∶1)抽提:上清液中加入等体积的氯仿∶异戊醇， 上下缓慢颠倒十次，在台式高速离心机上8 000 r/min离心10 min,取上清液；再次重复此步骤。
8）沉淀DNA：在上清液中加入2×体积的冷无水乙醇(预先置-20℃冰 箱内)沉淀DNA．冰箱内放置10 min，12 000 r/min离心 10 min, 弃上清液。
9）洗涤DNA：在留有沉淀的离心管中加入1 mL70%的冷乙醇洗涤 DNA，在台式高速离心机上10 000 r/min离心5 min,倾去上清液。
10）保存：自然干燥，加适量TE或无菌三蒸水溶解，于- 20℃保存备 用。 1.4.2饱和NaCl法[9 ,15 ]
（1）试剂及溶液 浸泡液（TE）：10mmol/Ltris-HCl、200mmol/LEDTA、50mmol/L NaCl pH8.0。 消化液：STE（0.1mol/L Nacl、10 mol/L Tris-HCl、1mmol/LEDTA pH 8.0、1 % SDS、200μg/ml Proteinase K。 蛋白酶K：2 mg/mL 饱和NaCl溶液、异丙醇、70%的乙醇。
（2）操作方法：
1)乙醇固定标本用无菌三蒸水浸泡48 h 以上,弃水;对干标本,用浸泡液（TE）浸泡48 h 以上，弃去浸泡液TE,取蝗虫后足股节肌肉。
2) 剪碎材料,加400μl 消化液于55℃消化8～12 h以上，然后加蛋白酶K（2 mg /mL），37℃继续消化1 h。
（1）试剂及溶液 2×CTAB缓冲液：0.1 mol/LTris-HCl，0.02 mol/L EDTA，1.4 mol/L NaCl，0.2%β-巯基乙醇，0.05 mol/L CTAB(pH 8.3)。 CI溶液：氯仿：异戊醇＝24∶1、70%的乙醇。
（2）操作方法： 1） 将蝗虫干标本和无水乙醇浸制标本用无菌三蒸水冲洗2～3 次; 用无菌三蒸水浸泡48 h 以上,弃水；弃去浸泡液,取蝗虫后足股节肌肉，速置于EP管中研碎。
2）加入2×CTAB缓冲液300 μL，以65℃温育60 min。然后，12 000 r/min 离心15 s，上清液倾出。
3）将原离心管中的剩余组织中再加入200 μL的2×CTAB缓冲液中， 轻轻打匀，65℃温育10 min后，10000r/min离心10 min，倾出上清液与第一次收集的上清液混合。 4）用等体积的CI抽提一次，10 000 r/min离心10 min，取上清液。
5）加入冰冷的异丙醇沉淀，8 000 r/min离心10 min。取沉淀，加70%乙醇200 μL，洗涤DNA沉淀，8 000 r/min离心6 min，倾上清液。
6）自然干燥，加适量TE或无菌三蒸水溶解，于- 20℃保存备用。 1.5电泳及结果记录 琼脂糖凝胶电泳检测： 试剂：琼脂糖，溴化乙啶染色液（EB）， 1×5TBE： Tris 54g、硼酸27.5g、0.5mol/L 的EDTA 20ml（pH 8.0），用三蒸水定容到1L，灭菌后贮存，稀释10倍后使用。 Loading buffer：0.25%的溴酚兰、40%的蔗糖，用三蒸水配制保存。
制胶：1、封好制胶槽并放置水平。
2、琼脂糖0.4g加40ml的1×0.5 TBE加热溶解透亮后摇匀。
3、待胶冷却至65℃时倒入制胶槽中厚度约5mm，插好梳子， 室温放置40min，待凝胶完全后小心的移去梳子。
4、将制胶槽放入电泳槽中，加入电泳缓冲液至淹没胶的表面。
上样：取样品DNA 5μl 和2μl的溴酚兰混匀后用移液枪点入胶孔， 注意加样前要混匀。
电泳：盖上电泳槽并通电，120V 恒压电泳40-60min。 染色: 将电泳好的琼脂糖凝胶放入EB中染色15min。
观察：放置在紫外分析仪上观察，然后用凝胶成像系统观察拍照。
2结果与分析
2.1总DNA的提取结果： 图1--图3为西伯利亚蝗虫基因组DNA 1%的琼脂糖凝胶电泳图。
Figure 1-- Figure 3 for Gomphocerus sibiricus genomic DNA of the 1% agarose gel electrophoresis testing plan.
图1 SDS-蛋白酶K消化法提取DNA的琼脂糖凝胶电泳图（5月4日） M：100bp标准分子量DNA 干制标本: 1-10：雌，10-20：雄； 乙醇浸泡标本：A- J：雌，K- T：雄。 M:100bp DNA molecular weight standards Dried specimens:1-10:female, 10-20:male; Ethanol soak specimens: A- J：female， K- T：male.
图 2 饱和NaCl法提取DNA的琼脂糖凝胶电泳图（5月9日） M: 100bp标准分子量DNA 干制标本: 1-5，11，12，13为雌性，6- 10：雄； 乙醇浸泡标本: A- E：雌，F- K：雄。
图3 CTAB法提取DNA的琼脂糖凝胶电泳图（5月11日） M: 100bp标准分子量DNA 干制标本: a-j: 雌，k-t: 雄; 乙醇浸泡标本：A-C: 雌, D-R: 雄 M:100bp DNA molecular weight standards Dried specimens:a-j:female, k-t:male; Ethanol soak specimens: A- C：female，D- R：male。
2.2结果与分析
一般认为，电泳检测后，若样品DNA条带整齐、无拖尾，则说明DNA较完整，也无杂质。反之，则认为DNA样品有降解或混有杂质[14]。通过检测发现本实验的的部分样品有明显的DNA条带，但都有不同程度的降解。
从图1可以看出，用SDS-蛋白酶K消化法提取的总DNA部分在3000bp处有一亮带，基本无拖尾，说明提取的DNA大分子较为完整。饱和NaCl法提取的总DNA从图2可以看出，此方法提取的效果相对较差，DNA弥散较大,未出现单条浓带，抹迹现象严重，以至用此方法提取的基因组DNA都无法用以PCR扩增。用CTAB法提取的DNA从图3可以看出，干标本只有一个样品提出了明显的DNA条带，无水处,但大部分都有拖尾,且拖尾现象比较严重，说明DNA样品有降解或混有杂质。三种方法比较结果表明，SDS-蛋白酶K消化法提取的效果最好，CTAB法次之，饱和NaCl法效果较差。 用酒精浸泡标本和干标本进行基因组DNA 提取的结果表明,无水乙醇浸制的标本提取的总DNA的得率及质量均较高，用三种方法均能得到部分良好的基因组DNA。而对于干标本三种方法提取的结果都不是很好。
3 讨论
3.1三种不同DNA提取方法的比较
分子生物学技术从核酸水平对昆虫进行物种鉴别以及探讨物种的起源和进化,是现代生物分子系统学和生物分子进化的研究热点之一 。有效的核酸提取方法是开展分子系统学研究的前提,不同生物的基因组DNA 的提取方法不尽相同,但主要的步骤是包括破膜释放DNA、抑制核酸酶和除去蛋白质与其它大分子等[6] 。本研究采用的三种方法所得到的结果显示各有优缺点如下： 方法1：SDS-蛋白酶K消化法，由于蛋白酶K的加入，研磨省时省力，无须低温操作，提取的DNA的浓度、纯度较好，适用范围广。因此，该方法可以用于对模板DNA质量要求较高的分子研究中，但该方法成本较高，耗时长，酚等药品价格高且对人体有害;需要转移上清液多次,有机抽提多次, 此过程中DNA有较大损耗，且浪费材料，步骤繁琐。 方法2 ：饱和NaCl法，操作简单，成本低廉，且不用接触酚乙醇浸泡的标本提取的总DNA有亮带在3000bp
（4）在SDS-蛋白酶K消化法中可能没有把蛋白质消化完全；
（5）在SDS-蛋白酶K消化法和CTAB法过程中酚的三次抽提和氯 仿已戊醇抽提中可能离心转速不够或时间不足，使上清液中还含有较多的杂质，影响了DNA的纯度。
此外,在基因组DNA的提取过程中，应尽量保证核酸一级结构的完整性，并最大限度地减少污染。为此，在实验过程中注意要简化操作步骤，缩短提取过程，避免使核酸处于高温，过酸或过碱的环境，以减少核酸变性降解等机会，同时在提取过程中注意实验技巧尽量减少化学及机械因素的影响。
虽然本次提取的结果不是很理想，但是有些样品的主带明显，而PCR扩增要求的模板DNA的质量不是很高，所以这些主带明显样品可以用来做PCR扩增，来进行更深一步的研究。本文比较了三种不同提取方法的优缺点，因此可以根据不同的实验条件和目的选择使用。当然随着分子生物学的快速发展，各种不同的DNA提取方法在不断的创新出现，相信这些方法在不断的优化后也可以提取到高质量的基因组DNA来满足更深层次研究的需要。
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[生物技术专业毕业论文]
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