【www.bbjkw.net--代表发言】
一、研究内容
【拟解决的关键科学问题】
以冠状病毒科、黄病毒科和疱疹病毒科中的代表病毒HCoV-HKU、JEV和HSV为主要研究对象，通过对I、II、III型病毒入侵机制的比较研究，发现其共性或规律，为设计相对广谱的抗病毒入侵药物提供新思路，是病毒病防治的重大需求。本项目将集中解决如下关键科学问题：
（1） 病毒包膜蛋白-细胞受体相互作用的分子机制。
（2） 病毒包膜蛋白变构诱导病毒-细胞膜融合的机理及其抑制。
其学术内涵包括：
1、HCoV-HKU、JEV等的入侵受体尚未确定
冠状病毒HCoV-HKU的入侵受体尚未确定；黄病毒JEV、疱疹病毒HSV在不同细胞上可以与不同细胞表面分子结合，但有些只是吸附因子而不是入侵受体。发现HCoV-HKU、JEV的细胞受体及研究受体的分子识别机制对于研究病毒包膜蛋白与细胞受体相互作用、病毒内化及病毒膜-细胞膜融合的分子机制等具有重要意义。而且，阐明这些科学问题将有助于揭示HCoV-HKU、JEV、HSV为代表的I、II、III型包膜病毒的入侵机制及规律，并为药物设计和新型疫苗研制提供科学依据和突破口。
2、HCoV-HKU、JEV、HSV病毒内化和病毒-细胞膜融合的机制仍不清楚
HCoV-HKU、JEV和HSV病毒内化、病毒膜与细胞膜融合等过程的分子机制均不清楚。除以上共性问题外，有待回答的问题还包括：（1）HCoV-HKU：尚无HCoV-HKU敏感细胞系；HCoV-HKU S 蛋白的激活方式及介导病毒入侵途径不明确；HCoV-HKU S 蛋白的抗原特性及病毒中和抗体表位尚有待研究。（2）JEV：对包膜蛋白中决定细胞、组织嗜性和毒力的相关位点不明确；对JEV入侵初始靶细胞、入侵抗原提呈细胞及入侵血脑屏障的分子机制均不清楚。（3）HSV：其入侵是通过4个病毒包膜蛋白gB、gD、gH、gL与细胞膜或内体膜蛋白相互有序的协同作用实现的。gD 是主要的受体结合蛋白，是HSV入侵的重要决定因素。尽管其胞外结构域晶体结构已经解析，但对受体选择使用的机制仍然了解甚少；gB有可能在融合中起关键作用，但仅有gB是不能完成HSV膜融合的；gH、gL在所有疱疹病毒中高度保守，并且对病毒的入侵与膜融合是必需的；目前对病毒入侵过程中gB、gD、gH、gL如何协同作用还不清楚。
3、HCoV-HKU、JEV、HSV包膜蛋白与受体互作的结构基础和入侵抑制仍是未知领域
HCoV-HKU S 蛋白、JEV E 蛋白和HSV gB、gD、gH、gL蛋白是病毒入侵的关键蛋白，除对gD、gB胞外结构域晶体结构进行了解析外，对HCoV-HKU S 蛋白、JEV E 蛋白和HSV gH、gL蛋白的结构仍不了解，也尚无针对HCoV-HKU、JEV、HSV的入侵抑制剂。揭示以上包膜蛋白与受体互作的结构基础将为药物和疫苗设计提供理想的靶位点。
【研究内容】
1、病毒的细胞受体及受体介导的内化
1.1、HCoV-HKU入侵受体、靶细胞入侵途径的研究
由于缺少细胞培养模型，HCoV-HKU侵染和致病机制的研究受到很大的局限。我们将通过建立多种假病毒系统，结合膜蛋白荧光差异2D技术分析A549、NIH-3T3等细胞膜蛋白的差异点，用标记及磁珠免疫共沉淀的方法，寻找与冠状病毒S蛋白和/或与其粘附相关的分子（如HLA-Cw0702）相互作用的病毒细胞受体或辅助因子，并确认这些蛋白的功能及与S蛋白相互作用方式。
包膜病毒结合相应受体后，可以直接和细胞膜融合（如HIV），也可以经内化后与胞内体进行膜融合（如流感病毒，HIV）。有些冠状病毒采用直接膜融合途径，而有些冠状病毒采用胞内体膜融合途径。本课题将对HCoV-HKU的膜融合途径进行详尽的研究。
1.2、JEV病毒受体分子的发现与确定
JEV能够感染多种细胞系，我们将综合采用生物化学和病毒学方法，针对不同的细胞模型，采用亲和纯化、cDNA文库或表型缺失文库来进行选择性的筛选。同时，将通过受体重建等多种途径和方式来确定所发现的病毒受体分子的功能特征。
1.3、JEV 入侵中枢神经系统的分子机制
JEV是具有代表性的脑炎病毒，且有成熟的细胞和动物模型，我们拟以已有的JEV强、弱毒株为模式病毒，在动物模型上，从体内层面研究病毒内化途径和诱导神经损伤的信号传递机制，以期揭示JEV的致病机理，为解析其它脑炎病毒如西尼罗河病毒等类似科学问题提供参考。
1.4、PI3K信号在HSV入侵中的作用
PI3K信号通路能影响多种细胞内的转运过程，包括物质分选、小泡形成（包括自噬体形成）和运送、膜融合等，在埃博拉病毒、流感病毒等的内化及复制过程中起重要作用。我们将研究PI3K-Akt信号通路在HSV感染早期的作用及病毒感染对PI3K信号通路的影响；确定PI3K-Akt信号通路在HSV膜融合及入侵过程起作用的主要下游效应蛋白，最终阐明HSV所利用的完整的PI3K信号通路及其作用。
2、病毒包膜蛋白及其介导的膜融合机制
2.1、HCoV-HKU S蛋白酶解激活机制研究
I型包膜病毒的融合蛋白前体一般需要酶解切割才能被激活而发挥膜融合功能。一些病毒包膜蛋白的酶解激活发生在向细胞表面的转运过程中，比如流感病毒HA和逆转录病毒的Env；而另外一些病毒膜蛋白的酶解激活则发生在病毒入侵靶细胞的过程中，比如埃博拉病毒和SARS-CoV。SARS-CoV S蛋白在病毒颗粒表面为未切割的三聚体，结合细胞受体后S蛋白可能发生构象改变，可以被组织蛋白酶L（cathepsin L）切割而被激活。HCoV-HKU S蛋白包含前体蛋白转化酶Furin切割位点，成熟的HCoV-HKU S蛋白可能在分泌途径中被Furin样宿主蛋白酶裂解。进一步深入研究HCoV-HKU S蛋白酶解激活途径是探讨病毒入侵机制的关键环节之一。
2.2、JEV膜融合过程中E蛋白的结构与功能、E蛋白毒力相关位点的研究
利用膜融合细胞模型和定点突变技术，研究和发现JEV E蛋白介导膜融合的关键位点或决定因子，同时以制备的构型依赖的E蛋白单克隆抗体，研究E蛋白在病毒融合过程中的构象变化；在利用生物信息学预测的基础上，利用假病毒和人工突变技术，构建JEV E蛋白突变子，并在不同组织、细胞上验证其细胞和组织嗜性，初步确定与病毒组织、细胞嗜性相关的功能位点；利用反向遗传学，构建JEV不同突变株，在细胞和动物活体水平上进行研究和验证。
2.3、HSV 包膜蛋白gH、gL、gD、gB的功能研究
以HSV为代表的疱疹病毒包含至少12个包膜蛋白，在病毒吸附、膜融合及入侵过程中起的作用各不相同，本研究以HSV-1为主要研究对象，利用已有的膜融合细胞模型，研究包膜蛋白与宿主受体以及包膜蛋白之间的相互作用，阐明各种包膜蛋白对病毒入侵的贡献；通过对gH、gL、gD、gB等主要包膜蛋白关键氨基酸的定点突变，发现病毒与宿主作用的关键基因和位点，为抗病毒药物提供新的靶标。
3、 病毒包膜蛋与受体互作的结构基础及抑制病毒入侵的新靶点的发现
3.1、病毒包膜蛋白与受体互作的精细定位
通过定点突变、嵌合体构建等分子生物学手段和假病毒技术，研究HCoV-HKU S蛋白、JEV E蛋白、HSV gD、gB蛋白等病毒包膜蛋白与受体相互作用的精细定位，发现包膜蛋白和细胞受体上决定病毒入侵的关键氨基酸位点或决定因子。
3.2、病毒包膜融合蛋白的三维结构
运用 X射线晶体学、核磁共振（NMR）技术或低温电子显微学等先进结构生物学方法和手段，并结合生物信息学，解析HCoV-HKU S蛋白NHR/CHR融合核心、JEV E蛋白及融合肽、HSV gH-gL复合体的三维结构，从结构角度分析这些蛋白质在病毒入侵宿主细胞过程中的功能，提出可能的入侵抑制手段。
3.3、发现靶向病毒受体结合域、病毒融合肽等位点的病毒入侵靶位点
根据3.1、3.2研究中发现的基于病毒包膜蛋白-受体互作或病毒融合肽的靶位点，设计、合成或筛选多肽或小分子抑制剂，在细胞水平测试其抑制活性。通过抑制实验，进一步对病毒入侵机制进行验证或确认，同时为新型抗病毒药物研发提供新靶标或新策略。
二、预期目标
【总体目标】
本项目根据我国将人类健康与疾病的生物学基础列为关键基础科学问题这一决策，聚焦国际上病毒病研究的重点和难点，立足于我国重要病毒性传染病的流行特点，选择冠状病毒、黄病毒和疱疹病毒中对我国具有严重危害或潜在危害的代表性病毒为研究对象，运用病毒学、免疫学、分子生物学和结构生物学等手段，揭示I、II、III型包膜病毒入侵的分子机制和规律，发现阻断包膜病毒入侵的药物和疫苗靶位点。本项目的完成将在包膜病毒入侵和抑制方面取得具有自主知识产权、领先于国际同类研究的创新性成果，提高我国在病毒入侵机制等传染病基础研究领域的研究水平和国际影响。
【五年预期目标】
1、 建立和完善分别用于HCoV-HKU、JEV和HSV病毒研究的假病毒体系或膜融合研究细胞模型。
2、 发现和鉴定HCoV-HKU、JEV的入侵、吸附受体。
3、 弄清受体介导的病毒内化及宿主信号对病毒内化的影响：明确HCoV-HKU S蛋白激活机制和病毒入侵途径；探讨PI3K信号通路在HSV膜融合及入侵过程中的作用，揭示自噬与HSV的关系。
4、 阐明包膜蛋白的功能及其介导的膜融合机制：解析HCoV-HKU S蛋白介导膜融合的关键位点、S蛋白中和抗体的抗原表位；探讨JEV E蛋白中与病毒的细胞、组织嗜性和毒力相关的功能位点；弄清HSV gH、gL、gD、gB 蛋白在膜融合中的功能。
5、 解析病毒包膜蛋白与受体互作的结构基础：从分子水平深入研究HCoV-HKU S蛋白、JEV E蛋白和HSV gD蛋白与受体作用的关键位点；运用生物物理学手段解析HCoV-HKU、JEV和HSV融合蛋白的三维结构。
6、 发现抑制病毒入侵细胞的新靶点：在基于对病毒-细胞膜融合机制了解的基础上，建立入侵抑制评价体系，设计和筛选针对包膜蛋白或受体的新型入侵抑制剂。
7、 培养一批在包膜病毒研究领域具有国际竞争力的优秀中青年科学家和后备人才；造就一支跨学科、跨领域、精诚合作、团结奋进的科研队伍。
8、 在包膜病毒入侵研究领域取得一些开拓性的科研突破，发表一批具有国际前沿水平的科研论文，获得拥有自主知识产权的技术成果。
三、研究方案
1、总体研究思路
本项目的总体学术思路是：立足于我国重要病毒性传染病的流行特点，选择冠状病毒、黄病毒和疱疹病毒中对我国具有严重危害或潜在危害的代表性病毒为研究对象，聚焦国际前沿的科学问题，以受体的发现-病毒内化及膜融合-病毒入侵的结构基础-入侵抑制为主线，从细胞、分子和原子水平，开展对包膜病毒入侵机制的原创性研究，揭示I、II、III型包膜病毒的入侵规律，为药物和新型疫苗设计提供科学依据。通过本项目的研究，希望形成一支在病毒入侵研究领域具有国际竞争力的优秀团队，以应对我国防治病毒性疾病这一重大需求，为应对突发公共卫生事件、构筑国家公共安全体系、保障人民健康提供技术支撑。
2、技术途径及可行性
本项目将利用病毒学、生物化学、分子生物学、细胞生物学和生物物理学方法，从体外（细胞、分子、原子水平）和活体等多个层面上开展包膜病毒入侵机制研究，为抗病毒入侵策略研究提供理论依据与技术支撑。
2.1、病毒模型：对于冠状病毒HCoV-HKU，由于尚无合适的敏感细胞系和动物模型，我们将通过假病毒体系和反向遗传学先从分子层面研究该病毒的入侵，然后再建立细胞模型； 对于黄病毒JEV，项目组成员已建立了敏感细胞和动物模型，我们将使用假病毒、活病毒及通过反向遗传学构建的病毒突变株同时在分子、细胞和活体水平展开研究；对于已有敏感细胞系和动物模型的HSV，我们将利用假病毒模型、具HSV表面糖蛋白表达的细胞模型等来研究包膜蛋白的功能，用重组活病毒来研究自噬和病毒内化。
2.2、细胞水平：通过假病毒感染模型和细胞-细胞融合模型，研究病毒包膜蛋白介导的病毒-细胞膜、细胞-细胞膜融合的机制；使用以上模型评价针对病毒入侵设计的分子抑制剂；利用活病毒和敏感原代细胞或细胞系，研究自噬和病毒内化机制。
2.3、生化、分子水平：利用生物化学、分子生物学方法，以包膜蛋白不同的功能结构域为诱饵，通过免疫共沉淀，酵母双杂交和蛋白质质谱筛选与宿主相互作用的膜蛋白，同时以表达cDNA文库克隆的方式进行受体筛选；通过病毒包膜蛋白基因定点突变、嵌合体构建等分子生物学手段和假病毒技术，阐述病毒包膜蛋白与受体相互作用的精细定位、包膜蛋白中与细胞/组织嗜性和毒力相关的功能位点；同时，从生化和分子层面表达和纯化包膜蛋白或蛋白片段、分析病毒包膜蛋白中和抗体的抗原表位。
2.4、原子水平：运用 X射线、NMR或高分辨低温电镜等先进结构生物学手段，并结合生物信息学，解析HCoV-HKU、JEV、HSV包膜融合蛋白或受体结合蛋白的三维构象；从结构角度分析这些蛋白在病毒入侵宿主细胞过程中的功能，提出可能的入侵抑制策略。
2.5、活体水平：重点研究JEV入侵中枢神经系统的分子机制。以小鼠为感染模型，通过免疫组织化学研究病毒入侵的初始靶细胞；通过病毒与小鼠树突状细胞体外共孵育，验证病毒对树突状细胞感染性、表型和功能的影响以及感染的分子机制；通过研究病毒包膜蛋白与大脑血管内皮细胞、神经细胞的互作机制，解析病毒穿越血脑屏障、入侵神经细胞的分子机制和诱导神经损伤的信号通路。
项目各个课题都有相关研究人员长期从事的本领域的研究基础，多个课题的相关研究人员在各自领域取得过突破性成果，在病毒受体发现、病毒膜融合机制、蛋白互作、蛋白空间结构预测和晶体分析、入侵抑制等方面具有优势力量。本项目依托3个国家重点实验室，4个部门重点实验室或研究中心，以及满足病毒研究需要的BSL-3/ABSL-3实验室和实验动物设施，已有相当规模和优良的实验条件，具备完成本项目所必备的实验平台和设施设备。
3、创新性
病毒感染与致病是一个非常复杂的过程，病毒入侵是病毒生命周期中关键的一步，也是设计药物和疫苗的理想靶位点，本项目针对病毒入侵就本领域的前沿科学问题开展原创性研究。首先，对于HCoV-HKU（I型）和JEV（II型），目前还没有公认的受体被鉴定出来，因此，发现HCoV-HKU、JEV的新受体，无论是对阐明病毒入侵的分子机制、还是对发现阻断病毒入侵的分子途径，都至关重要，本项目成员在发现和鉴定包膜病毒受体方面有丰富的经验，作出过重要贡献（Li et al, Nature, 2003），为本方向的开展奠定了基础。其次，在包膜病毒融合机制方面，我们项目组成员通过研究HIV、SARS-CoV、mERV、AcMNPV等包膜病毒取得过一系列国际前端性成果（He et al, J Virol, 2008a，2008b; Peng et al, J Biol Chem 2007；Wang et al, J Virol, 2008; Tan et al, J Virol, 2008），在已有的理论和技术支撑下，对在入侵机制上尚不清楚的HCoV-HKU、JEV和HSV开展联合攻关，将保证我国在该领域的领先地位。再者，在HCoV-HKU、JEV和HSV研究领域，其包膜蛋白与受体互作、结构基础、入侵抑制等方面仍然是空白，本项目聚焦的是以上方面的国际前沿科学问题，将通过本项目组成员在包膜蛋白与受体互作（Li et al, EMBO J, 2005, J Virol, 2006; Hu et al, J Virol, 2000, J Mol Biol, 2005）、包膜蛋白结构解析（Li et al, Science, 2005; Tang et al, J Virol, 2008）、入侵药物设计和入侵抑制（Liu et al, Lancet, 2004; Hu et al, J Exp Med, 2004；He et al, PNAS, 2008）等方面获得的成功经验和技术手段去回答以上科学问题。总之，本项目从选题和提出科学问题上保证了创新性，并充分利用了我们现有的工作基础，以充分发挥集中攻关的优势。
4、课题设置
本项目围绕阐明病毒入侵分子机制的总目标，通过发现或确定冠状病毒HCoV-HKU、黄病毒JEV等的细胞受体（课题一）；揭示受体介导内化的机理，比较I（课题二）、II（课题三）和III（课题四）型病毒包膜蛋白介导的膜融合机制，以期发现入侵机制及共性规律；结构研究是理解病毒-受体相互作用、病毒膜融合过程中膜蛋白构象变化的重要基础，入侵抑制研究既是对入侵机制的进一步验证或确认，又是入侵理论的应用 （课题五）。本项目课题之间的相互关系如图所示。
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课题一、重要包膜病毒新受体的发现
主要研究内容：1、HCoV-HKU受体分子的发现与确定；2、JEV受体分子的发现与确定。
研究目标：发现和确定HCoV-HKU（I型）、JEV（II型）的入侵或吸附受体。
承担单位：北京生命科学研究所，武汉大学
课题负责人：李文辉
学术骨干： 曹志贱、王业富、孙银燕
经费比例：18.78%
课题二、I型包膜病毒的入侵机制
主要研究内容：1、HCoV-HKU假病毒体系的建立；2、HCoV-HKU S蛋白酶解激活机制研究；3、HCoV-HKU靶细胞入侵途径的研究；4、HCoV-HKU入侵中和抗体及抗原表位的研究。
研究目标：以HCoV-HKU1为主要研究对象，探讨I型包膜病毒的入侵机制，为发展病毒入侵抑制剂和抗病毒疫苗提供理论依据。
承担单位：中国医学科学院病原生物学研究所，中国科学院微生物研究所
课题负责人：何玉先
学术骨干： 刘长梅、种辉辉
经费比例：14.33%
课题三、II型包膜病毒的入侵机制
主要研究内容：1、JEV E 蛋白介导膜融合的分子基础；2、JEV包膜蛋白中与细胞、组织嗜性和毒力相关的功能位点；3、JEV入侵中枢神经系统的分子机制。
研究目标：以JEV为主要研究对象，围绕病毒入侵细胞分子机制这一科学问题展开研究，为发现JEV等II型包膜病毒的入侵规律和抗病毒药物、新型疫苗的设计提供科学依据。
承担单位：中国科学院武汉病毒研究所，华中农业大学
课题负责人：王华林
学术骨干： 钱平、曹胜波、邓菲、张化俊
经费比例：20.44%
课题四、III型包膜病毒的入侵机制
主要研究内容：1、HSV 包膜蛋白gH、gL、gD、gB的功能研究；2、HSV包膜蛋白构象变化及与小分子结合的研究；3、研究PI3K信号通路在HSV膜融合和入侵中的作用。
研究目标：以HSV-1为主要研究对象，研究和揭示III型包膜病毒入侵机制，为这一类病毒的药物及疫苗的设计提供重要的理论指导。
承担单位：中国科学院微生物研究所，中国科学院广州生物医药与健康研究院
课题负责人：严景华
学术骨干： 彭涛、姜学军
经费比例：14.33%
课题五、病毒包膜蛋白与受体互作的结构基础及入侵抑制
主要研究内容：1、病毒包膜蛋白与受体相互作用的精细定位；2、解析病毒包膜蛋白或融合核心的三维结构；3、发现靶向病毒受体结合域、病毒融合肽等位点的病毒入侵抑制药靶。
研究目标：系统地解析以I型HCoV-HKU、II型JEV和III型HSV为代表的包膜病毒入侵过程所涉及的病毒包膜蛋白或蛋白质复合物的关键位点和三维结构，分析并阐明这些蛋白在病毒入侵宿主细胞过程中的重要功能，设计并优化可能的入侵抑制剂，提出可能的入侵抑制手段。
承担单位：中国科学院武汉病毒研究所，南开大学
课题负责人：胡勤学
学术骨干： 肖庚富、周卫红、郑春福、黄文杰、刘君
经费比例：32.11%
四、年度计划